核酸提取是指將核酸（DNA和RNA）從細(xì)胞中提取出來(lái)的過(guò)程，總的來(lái)說(shuō)包括細(xì)胞裂解、核酸純化及后續(xù)核酸濃度、純度測(cè)定的步驟。根據(jù)原始樣品的種類(lèi)和核酸產(chǎn)物后續(xù)的各種應(yīng)用目的，細(xì)胞裂解和核酸純化步驟有不同的處理方法和要求。
一、實(shí)驗(yàn)室中的DNA提?。?/b>
案例一：小鼠基因型判定實(shí)驗(yàn)的模板DNA提取
初始樣品為小鼠尾切段。基因型判定實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA模板的濃度、純度要求不高，消化提取過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.將1cm尾巴切段置于1.5mL微量離心管中，加入適量裂解液（Lysis buffer）和蛋白酶（Proteinase K）于55~65℃水浴過(guò)夜消化。
2.充分消化后的尾巴樣品加入沉淀液（Precipitation buffer）后用旋渦混勻器來(lái)使雜質(zhì)蛋白充分沉淀，雜質(zhì)沉淀后通過(guò)離心操作（如4℃，4000Xg，5min），取出溶有目標(biāo)DNA的上清液，丟棄雜質(zhì)沉淀。
3.上清液中加入100%異丙醇，小心顛倒離心管30~40次，便可以將產(chǎn)物DNA沉降。離心操作（4℃，10000Xg或12000rpm，10min）去除上清。
4.用75%乙醇洗滌兩次DNA產(chǎn)物，待乙醇充分揮發(fā)后，用水或TE緩沖液（Tris-EDTA buffer）收獲DNA模板產(chǎn)物。
進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)前，可以使用Nanodrop儀器來(lái)進(jìn)行DNA濃度和純度的測(cè)定來(lái)提高PCR反應(yīng)的成功率。在PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)不順利的情況下，也可以進(jìn)一步對(duì)DNA產(chǎn)品的完整度進(jìn)行檢測(cè)，具體方法可以參考核酸檢測(cè)和核酸擴(kuò)增的有關(guān)內(nèi)容。
案例二：用于重組的質(zhì)粒DNA提取
用于重組的質(zhì)粒對(duì)DNA產(chǎn)物的濃度、純度和完整度都要求較高，否則無(wú)法成功完成質(zhì)粒酶切和酶連的步驟。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.從含有過(guò)夜培養(yǎng)大腸桿菌的試管中取出適量菌液置于微量離心管中，低速離心（4000Xg， 5min）處理后收獲大腸桿菌，除去培養(yǎng)液。
2.使用質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid DNA extraction kit)提取大腸桿菌質(zhì)粒。原理菌體裂解后，加入中和液（Neutralization buffer）過(guò)微型柱，使DNA特異結(jié)合于柱上，而其他雜質(zhì)會(huì)過(guò)柱洗脫。最后用洗脫液(Elute buffer)洗下DNA即可得到質(zhì)粒DNA產(chǎn)物。
3.經(jīng)試劑盒提取后的質(zhì)粒DNA有時(shí)需要經(jīng)電泳切膠回收的操作將目標(biāo)質(zhì)粒DNA與其他DNA分離。切下的膠消化后經(jīng)DNA純化試劑盒純化即可得到純度較高的目標(biāo)質(zhì)粒DNA。具體的內(nèi)容可以參考核酸檢測(cè)的有關(guān)內(nèi)容。
二、實(shí)驗(yàn)室中的RNA提取
[ RNA Extraction: Principle, Procedure, Protocol and Importance – Genetic Education]：
RNA提取過(guò)程與DNA類(lèi)似，也是通過(guò)裂解細(xì)胞后通過(guò)有機(jī)溶劑（苯酚、氯仿、異戊醇）沉降雜質(zhì)的方法來(lái)分離RNA。但RNA的穩(wěn)定性比DNA低很多，因此對(duì)RNA提取對(duì)溫度和污染清除的要求更高。實(shí)研操作一般從以下幾個(gè)角度來(lái)提升成功率：降低RNA水解酶活性、提升RNA穩(wěn)定性、使RNA與DNA和蛋白分離、僅沉降RNA、有效去除DNA。
案例一：總RNA提取
實(shí)驗(yàn)步驟與DNA提取類(lèi)似，但有機(jī)溶劑的使用會(huì)有所不同。在首次離心后，混合物會(huì)分為三層，RNA溶于上層無(wú)色水相，而DNA和蛋白會(huì)處于中間層，組織殘?jiān)入s質(zhì)處于底層酚-氯仿相中2。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.向提取樣品中加入裂解液（如Trizol），裂解細(xì)胞與組織，室溫靜置5-8分鐘。
2.加入氯仿，充分混勻后離心（4℃，12000rpm，10min），取出上清液。
3.向上清液中加入異丙醇沉降RNA，并離心（4℃，12000rpm，10min）棄去上清。
4.用75%乙醇洗滌產(chǎn)物兩次，待乙醇揮發(fā)后加入RNase-free水溶解產(chǎn)物。
實(shí)驗(yàn)中用到的耐思耗材和儀器：
槍頭、微量離心管、（15、50mL）離心管、迷你旋渦分離器（105003）。
