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2022-11-303153 次瀏覽
核酸檢測

一、實驗室常用核酸的濃度與純度檢測

核酸濃度與純度檢測最簡單常用的儀器是微量紫外分光光度計，代表為NanoDrop。NanoDrop分光光度計利用分子的紫外吸收特性來測定樣品濃度。核酸吸收峰為260nm，蛋白樣品吸收峰為280nm。此外，很多提取過程中殘留的污染物通常在280nm和230nm處有吸收峰。[ NanoDrop Spectrophotometer Resources | Thermo Fisher Scientific - CN]樣品濃度與吸光度成正比關(guān)系（Beer-Lambert Law），因此通過測定吸收峰就可以得出核酸樣品的濃度。

核酸樣品的純度可以由A260/A280、A260/A230兩個比值來反應(yīng)。純度較高DNA的A260/A280應(yīng)在1.8左右，RNA在2.0左右。若DNA樣品的A260/A280數(shù)值偏向2.0，則表明存在RNA污染，如有需要應(yīng)使用RNA酶處理樣品并純化，反之亦然。A260/A230數(shù)值可以反應(yīng)樣品中有機(jī)物污染水平，一般大于2.0則較好，若偏低則表示產(chǎn)物中含胍或乙醇等有機(jī)物的污染（如表1所示）。


比值 測定樣品 “純”樣品的比值范圍 比值異常的原因
A260/A280 核酸 DNA: ~1.8 RNA: ~2.0 造成低比值的污染物： -蛋白質(zhì) -核酸提取步驟中的殘余苯酚和其他試劑
A260/A230 核酸 DNA/RNA: ~2.0-2.2  

 造成低比值的污染物： -蛋白質(zhì) -碳水化合物 -提取中的殘余苯酚 -殘余胍（常見于提取柱類方法） -用作輔助沉淀劑的糖原 造成高比值的原因： -空白對照有誤
A260/A280 蛋白 ~0.6 造成高比值的污染物： -核酸

表一 紫外吸收法反應(yīng)純度的關(guān)鍵比值2

DNA的濃度檢測經(jīng)常會影響后續(xù)實驗的操作，濃度過高和過低都會影響PCR、酶切酶連等反應(yīng)的進(jìn)行。因此要進(jìn)行適當(dāng)稀釋，保證反應(yīng)體系中DNA終濃度在合適的范圍內(nèi)。
另外一種常用的核酸檢測方法為熒光光度法（代表常用儀器為Qubit），利用核酸與靶標(biāo)選擇性染料結(jié)合后發(fā)光的原理來檢測濃度，可以檢測濃度非常低的樣品，靈敏度比紫外分光光計高。該方法檢測不同性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的核酸時需要特定的試劑盒，因此成本較高。

二、實驗室核酸樣品質(zhì)量檢測
核酸電泳是常用于檢測DNA與RNA完整性的方法。將核酸樣品加入瓊脂糖凝膠上的加樣槽后，通過電泳作用，不同大小的核酸分子會以不同速率向正極遷移。長鏈、環(huán)形的核酸遷移速度比短鏈、線型的核酸分子慢。通過熒光染料溴乙錠或商品化染料SybrGreen、GelRed等染料染色，電泳結(jié)束后即可在紫外下觀察核酸分子的遷移情況。與核酸大小標(biāo)準(zhǔn)物對比即可判斷核酸樣品是否存在斷裂或污染的情況。

NanoDrop Spectrophotometer Resources | Thermo Fisher Scientific - CN
NanoDrop Spectrophotometer Resources | Thermo Fisher Scientific - CN

核酸檢測過程中可以用到的耐思耗材：
槍頭（100μL、200μL、1000μL等）；微量離心管（1.5mL、2mL）；PCR管類。
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