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細(xì)胞攻略

293T細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞特點(diǎn)

01.細(xì)胞貼壁能力比較弱

293T細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，但其貼壁能力比較弱，容易出現(xiàn)明顯的成片脫落現(xiàn)象。比如：運(yùn)輸?shù)蜏丶罢鹗?、在室溫條件下靜置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、添加的培養(yǎng)基或其他試劑溫度過(guò)低、培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞密度過(guò)高、細(xì)胞聚集時(shí)未吹散、加液吹打時(shí)觸碰了細(xì)胞表面等。

若脫落現(xiàn)象不嚴(yán)重應(yīng)將細(xì)胞盡快放回培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若出現(xiàn)大片脫落的現(xiàn)象需要收集細(xì)胞重新消化吹散再接種。

建議使用經(jīng)TC處理后的培養(yǎng)器皿培養(yǎng)細(xì)胞，如NEST細(xì)胞培養(yǎng)瓶、NEST細(xì)胞工廠等。

02.細(xì)胞本身偏嗜酸性，培養(yǎng)基消耗較快

293T細(xì)胞在略偏酸性的環(huán)境下生長(zhǎng)狀態(tài)更好，在培養(yǎng)過(guò)程中需要時(shí)刻注意培養(yǎng)基的pH值。

在細(xì)胞密度達(dá)到70%以上時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)基的消耗速度較快，需要時(shí)刻觀察并及時(shí)換液。

03.細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)聚集成島

293T細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)呈島狀聚集生長(zhǎng)，會(huì)逐步向外擴(kuò)散直到完全融合。

04.細(xì)胞聚集成團(tuán)之后很難再吹散

293T細(xì)胞傳代過(guò)程中一定要注意吹散細(xì)胞，同時(shí)接種的密度不可過(guò)高。密度過(guò)高容易使細(xì)胞抱團(tuán)，導(dǎo)致難以再次吹散，會(huì)在培養(yǎng)器皿中形成類似于球狀的聚集體貼壁生長(zhǎng)。導(dǎo)致即使培養(yǎng)條件合適細(xì)胞也難以生長(zhǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)

01.細(xì)胞凍存

1. 隨著傳代的次數(shù)增加，293T細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等現(xiàn)象。所以我們需要在細(xì)胞購(gòu)進(jìn)時(shí)就進(jìn)行大量?jī)龃?，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。

2. 在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行凍存，從而增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。

3. 倒去細(xì)胞上清液并洗去殘留的培養(yǎng)基。

4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后移除。

5. 鏡下觀察，當(dāng)293T細(xì)胞變圓且細(xì)胞間間隙加大時(shí)，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻。

6. 細(xì)胞計(jì)數(shù)。

7. 將細(xì)胞離心，1000rpm，2min。

8.根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，密度為3×10^6個(gè)/mL。

9. 將細(xì)胞重懸液分裝進(jìn)細(xì)胞凍存管，進(jìn)行凍存。

10. 液氮?dú)庀蟊４?4小時(shí)后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)細(xì)胞存活率，細(xì)胞狀態(tài)等，若細(xì)胞活性合格可長(zhǎng)期保存，若細(xì)胞活性合格率低于80%建議重新凍存。

注：NEST生物樣本庫(kù)解決方案提供細(xì)胞凍存全流程產(chǎn)品，如NEST凍存管、NEST凍存液、NEST樣本管理系統(tǒng)、NEST凍存架等。

02.細(xì)胞傳代

1. 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率達(dá)到80~90%需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2. 吸取干凈原有培養(yǎng)基，加入3-4mL常溫PBS輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞10-20秒后舍棄PBS。

3. 加入適量胰酶，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶使胰酶與細(xì)胞充分混勻，徹底消化細(xì)胞。

4. 當(dāng)細(xì)胞間隙變大，但并未完全脫落時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)基，終止消化?；靹蚣?xì)胞，900rpm離心3-5分鐘后舍棄上清液。

5. 加入新的培養(yǎng)基重選細(xì)胞并均勻分到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，靜置培養(yǎng)。

6. 傳代完成24小時(shí)后建議觀察細(xì)胞并換液，以去除死亡細(xì)胞。

注：NEST細(xì)胞培養(yǎng)瓶規(guī)格齊全，表面經(jīng)過(guò)TC處理，細(xì)胞貼壁效果極佳。同時(shí)NEST已推出新品細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞鹽溶液（PBS），助力細(xì)胞培養(yǎng)。

03.細(xì)胞復(fù)蘇

1. 當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多（超過(guò)50代），細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)或細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時(shí)，需要丟棄原有細(xì)胞并對(duì)一開(kāi)始凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。

2. 打開(kāi)水浴鍋，設(shè)置溫度為40℃。

3. 查看NEST樣本管理系統(tǒng)的記錄，根據(jù)記錄從液氮?dú)庀笾腥〕鰞龃娴募?xì)胞，迅速丟入水浴鍋中并快速晃動(dòng)，在1~2 min內(nèi)使細(xì)胞溶液完全溶解。

4. 加入培養(yǎng)基中并混勻后轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

5. 放回37攝氏度、3%二氧化碳和95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6. 第二天觀察細(xì)胞存活率。倒掉舊的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基。注：可使用耐思新推出細(xì)胞復(fù)蘇儀替代原始細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程，細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)間短，細(xì)胞存活率高。

Q&A

01.細(xì)胞密度如何計(jì)算

常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長(zhǎng)密度的比值，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值。

這種計(jì)算方式優(yōu)點(diǎn)是直觀簡(jiǎn)便，但受限于單個(gè)細(xì)胞在不同的生長(zhǎng)密度時(shí)所占用的培養(yǎng)面積不同，導(dǎo)致計(jì)算并不嚴(yán)謹(jǐn)。

02.培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞碎片較多

細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡以及細(xì)胞器的折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變。而細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境不適應(yīng)、缺乏營(yíng)養(yǎng)、滲透壓有異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議適當(dāng)改變培養(yǎng)條件。
細(xì)胞外的黑色顆粒為細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，需要先舍棄原有培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗清除細(xì)胞碎片，加入新的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。
如果潤(rùn)洗無(wú)法清除細(xì)胞碎片，可以等細(xì)胞密度處在70-80%左右時(shí)消化處理細(xì)胞，終止消化之后混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液在900-1000rpm條件下離心3分鐘，舍棄上清液。重懸細(xì)胞→離心→再重懸后將細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)瓶。
第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果碎片很多，建議用PBS多次潤(rùn)洗細(xì)胞。

03.細(xì)胞出現(xiàn)聚團(tuán)現(xiàn)象

細(xì)胞傳代過(guò)程中需要盡可能地吹散細(xì)胞，并在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞基本分散后再把細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中。
優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)體系能有效避免細(xì)胞吹散后在貼壁時(shí)再聚團(tuán)的現(xiàn)象，也可以減輕細(xì)胞聚團(tuán)后無(wú)法重新攤開(kāi)生長(zhǎng)的癥狀。
培養(yǎng)過(guò)程中輕微聚團(tuán)可以稍微延長(zhǎng)消化時(shí)間，讓大團(tuán)細(xì)胞塊下沉后吸取上層的分散細(xì)胞進(jìn)行傳代。若聚團(tuán)過(guò)于嚴(yán)重建議重新培養(yǎng)或者更換培養(yǎng)體系。

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